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第1章绪论

1．1研究背景

1．2研究现状．

参考文献

第2章; 间充质干细胞冷冻过程中水的

跨膜传输和胞内冰晶形成概率

2．1; 引言

2．2 Mazur水输运方程

2．3 Toner胞内冰形成概率

2．4实验平台搭建

2．5实验步骤

2．6间充质干细胞在不同降温速率条件下水输运的研究

2．7间充质干细胞形成胞内冰概率统计

2．8本章小结

参考文献

第3章; 封装有干细胞的水凝胶胶囊在冷冻过程中

冰晶形成和玻璃化研究

3．1; 引言

3．2实验材料与方法

3．3结果与讨论

参考文献

第4章水一水一水模板化制备微胶囊工艺研究

4．1; 引言

4．2实验材料与方法

4．3结果与讨论

参考文献

第5章; 纤维状水凝胶封装细胞的玻璃化保存和3D培养

5．1; 引言

5．2实验材料与方法

5．3结果与讨论

参考文献

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第

pan style="font-family:宋体">章

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绪

论

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pan style="font-family:宋体">研究背景

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低温生物医学工程的原理和应用

低温生物医学工程是一门将低温保存技术工程化并应用于生物医学领域的交叉学科。人们通常需要保存医学上常用的生物材料，在细胞层面上如精子、卵细胞和血细胞等，在组织层面上如肌腱、角膜和血管等括器官和完整生命体的保存。低温生物医学工程一括以下几个方面：冷冻损伤机理、低温生理、冷冻外科和低温及生物材料的低温保存与应用。同时，低温生物医学工程的适用范围广阔，而且在不同的领域展现出不同的应用效果，既可以在低温环境下保存细胞、组织和器官，也可以利用冷冻来杀死病变组织。低温冷冻保存是指把生物的细胞、组织以及器官在低温或者深低温下保存以备后期应用，当然对于人类而言实现生命个体的完整保存是终理想。一般情况下，低温是指

O

℃左右，用于生物样品的短期保存；深低温是指一

80

℃以下，多用于生物样品的保存。随着低温生物医学的研究和发展，近些年将低温保存人的细胞、组织和器官应用于临床的案例越来越多，例如用于生殖医学中的卵细胞和胚胎低温冷冻保存，用于干细胞工程中的胚胎干细胞低温保存，用于临床的稀有血型血液等低温冷冻保存等。低温冷冻虽然可以起到保存细胞的作用，但在保存过程中也必然会对细胞造成的损伤，研究低温保存的目的是尽可能地减少保存过程中细胞的损伤。同时，人们也探索如何在冷冻过程中大限度地杀死细胞的原理，应用到低温手术中快速、杀死组织‘¨。因此，低温生物医学一方面探索生物细胞组织的冷冻规律，另一方面探索在冷冻过程中如何大限度杀死细胞

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。

]

。

低温冷冻的目标是实现生物样本的低温保存。

1949

年，英国生物学家

A

．

U

．

Smith

和

C

．

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在实验过程中无意间发现把精子放入含有甘油的水溶液中，然后置于低温环境中精子不会死亡。这个有趣的发现在《自然》杂志上发表后引起了人们的广泛关注，同时成为真正具有科学意义的低温保存的开端。生物体能行低温保存是因为其生理代谢作用在低温下受到了。当温度降到程度时，机体内细胞所有的生理代谢活动基本停止，可以理解为生物体处于“静止”的状态。人们把代谢活动和温度的关系归结为阿伦尼乌斯

(Arrhenius)

公式：

忌一

Aexp[

一

E

。／

(RT)]

式中是——代谢反应速率；

A

——反应常数；

R

——摩尔气体常数；

T

——温度；

E

。——反应活化能。

根据上式不难发现：温度越低，生物体的代谢速率会越慢。通过

Arrhenius

公式可以估算出：在一

196

℃

(

液氮

)

环境下的生物样品可以保存长达几，在这个温度下生物的生理代谢活动急剧减弱，几乎可以认为停止，所以在生物样本的保存过程中低温可以使时间“减慢甚停止”

H]

。这也是所有生物样品能够在低温下得到保存的理论基础。

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2

低温保存过程中细胞的损伤因素

美国橡树岭国家实验室的

P

．

Mazt-r

是低温生物医学学科的创始人之一，他为生物热力学的发展作出了很大的贡献。

1972

年，他提出了细胞在冷冻过程中损伤的两因素假说

H]

：这是一个根据冷冻过程中溶液的结冰量，并对渗透过行定量分析后建立起来的方程。因为各种细胞体积不同，其细胞膜对水的渗透量也不同，所以在低温保存过程中不同的细胞有着不同的佳降温速率。如图

l

一

1(a)

所示，如果降温速率太慢，则细胞外溶液相对细胞内溶液优先接触外边冷源而慢慢结冰。因此，细胞外溶液浓度会不断升高，细胞内外形成渗透压差，细胞内水分将不断渗出，细胞处于高浓度的溶液环境下，从而导致细胞强烈收缩。如果细胞过度收缩，则会造成细胞骨架和一些蛋白质结构遭到破坏，即细胞长时间处于高浓度的溶液中会受到损伤

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“

]

，这是造成细胞低温损伤的个因素即溶液损伤。同时，如果降温速率过快，则细胞内溶液来不及往细胞外渗透，会因过冷而结冰，这是造成细胞低温损伤的个因素，被称为胞内冰损伤。那么在这两个因素的共同制约下，必然存在一个佳的降温速率。

P

．

Maztlr

的理论很好地解释了低温保存实验中出现的现象。如图

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1(b)

所示‘川，冷冻不同的细胞需要选择不同的佳降温速率，因此，根据这个理论，人们可以选择适合不同细胞的佳冷冻方案，实现对不同细胞的低温冷冻保存。在细胞和组织的冷冻过程中，不合适的降温速率也会导致细胞内的

pH

降低，从而使得整个冷冻过程中细胞内的环境会从中逐渐转变为酸。如果

pH

变化太......

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